Чалфи е роден и израства в [[Чикаго]], [[Илинойс]]. Баща му е китарист, а майка му държи магазин за дрехи. Баща му по майчина линия имигрира в града от [[Москва]] на ранна възраст. Прародителите му по бащина линия пък са имигрирантиимигранти от [[Брест-Литовск]].<ref>[http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/chalfie.html?print=1 Autobiography on Nobelprize.org]</ref> Приет е в [[Харвардския университет]] през 1965 г., като желае да изучава главно математика.<ref name="Davis_2008_01_28">{{cite web|title=Profile of Martin Chalfie|date=2008-01-28|url=http://www.pnas.org/content/105/5/1393.full|publisher=National Academy of Sciences|author=Tinsley Davis in Proceedings of the National Academy of Sciences}}</ref> Впоследствие се насочва към [[биохимия]]та, тъй като тя комбинира интересите му в химията, математиката и биологията.<ref name="Davis_2008_01_28"/> След първи курс прекарва летата си, работейки в лабораторията на Клаус Вебер в Харвард. По това време той се обезсърчава от неуспехите си и решава, че не би трябвало да се занимава с биология.<ref name="Wu2008_10_09">{{cite web|publisher=Harvard Crimson|title=Harvard Alumni Win Nobel Prize|author=June Q. Wu|url=http://www.thecrimson.com/article.aspx?ref=524525|date=9 октомври 2008}}</ref> Поради тази причина, той тръгва на курсове по право, театър и руска литература.<ref name="Davis_2008_01_28"/> Освен това, той се състезава в отбора по плуване на Харвард и става негов капитан.<ref>{{cite web|url=http://www.thecrimson.com/article.aspx?ref=139729|title=Chalfie is named tankers' captain|date=21 март 1968|publisher=Harvard Crimson}}</ref>
След каткато озавършвазавършва висшето си образование през 1969 г., той работи на редица временни работи – продава дрехи за семейния бизнес в Чикаго<ref name="Davis_2008_01_28"/> и преподава в [[Хамден (Кънектикът)|Хамден]], [[Кънектикът]].<ref name="Davis_2008_01_28"/> През лятото на 1971 г. изследванията му в лаборатория на [[Йейлския университет]] водят до първата му публикация. С възродено самочувствие, той се завръща в Харвард, за да продължи обучението си и да получи докторска степен през 1977 г.<ref name="Davis_2008_01_28"/>
